2026.08.12

AVATAR 應用案例｜缺氧高壓微環境馴化：ahCAR‑T 體外實體瘤殺傷活性獲得提升

嵌合抗原受體CAR-T 細胞療法在血液系統惡性腫瘤中展現出優異的治療效果，但針對實體瘤的臨床療效存在明顯局限，核心誘因之一是腫瘤微環境（Tumor Microenvironment，TME）介導的 T 細胞耗竭與細胞功能受損。腫瘤微環境具備缺氧、組織間隙高壓等典型理化特征，能夠決定性調控 T 細胞的生物學功能。基於體外構建腫瘤微環境模型對 T 細胞開展表型重塑與代謝重編程，是提升 T 細胞在實體瘤病竈內抗腫瘤效應的潛在新思路。

AVATAR Odyssey

本研究采用美國 Xcell Biosciences公司AVATAR Odyssey細胞培養系統，精準調控培養體系的氧氣濃度與靜水壓，體外復刻腫瘤微環境的理化脅迫特征。實驗選取四類效應細胞：未轉導活化T細胞（UTD-ATC）、雙特異性抗體修飾的未轉導T細胞（BAT）、未修飾無頭型CAR-T細胞(hCAR-T)、雙特異性抗體武裝無頭型 CAR-T 細胞（ahCAR-T）。將各組細胞分別於常規培養條件（Normal Environment, NE，21% O₂）、AVATAR Odyssey 系統構建的模擬腫瘤微環境（低氧聯合高壓）中擴增培養，後續與腫瘤靶細胞進行共培養實驗，系統性解析培養環境差異對 T 細胞增殖能力、免疫表型分化及抗腫瘤功能活性的作用。

實驗方案

1. hCAR-T細胞培養條件

細胞復蘇後，以可溶性抗CD3抗體（OKT3）聯合100 IU IL-2過夜刺激，隨後分組培養：標準培養箱（NE, 21% O₂，0 psi）、TME1（15% O₂，5 psi）、TME2（10% O₂，5 psi）、TME3（5% O₂，5 psi）。擴增8天後，流式細胞術檢測hCAR表達、記憶亞群（TCM/TEM/TEMRA/Naive）、葡萄糖轉運蛋白1（GLUT-1）及活化標誌物CD69。

2. hCAR-T細胞功能檢測

功能實驗前，以OKT3/HER2雙特異性抗體對T細胞進行武裝。將HER2武裝型hCAR-T細胞與HER2陽性靶細胞（LNCaP, PANC-1, SKBR-3, MCF-7）共培養。實驗分為兩組：NE組（標準培養箱）與TME組（AVATAR Odyssey, 1% O₂，2 psi）。效靶比從8:1開始，2倍梯度稀釋，共培養72小時後流式細胞術檢測腫瘤殺傷率。

實驗結果

1. 不同培養環境下hCAR-T 細胞的 CAR 表達、增殖及表型分析

TME3條件（5% O₂，5 psi）下，hCAR表達中位值最高（50%），但T細胞擴增倍數隨氧濃度降低而下降（NE :42倍 vs TME3:26倍）。值得註意的是，CD3⁺與CD4⁺T細胞以中央記憶T細胞（TCM）為主，而CD8⁺T細胞則以初始 T 細胞（TNaïve）和終末效應記憶 T 細胞（TEMRA）為主（圖1）。

圖1. 不同培養環境對CAR-T細胞功能表型和亞群的影響

2. 流式細胞術檢測腫瘤微環境下 ahCAR-T 細胞的殺傷活性

流式細胞術結果顯示，針對MCF-7、SKBR-3及PANC-1細胞，在低效靶比（2:1， 1:1）條件下，經TME擴增的ahCAR-T細胞展現出顯著優於NE組及未武裝組的腫瘤殺傷能力（圖2）。

圖 2. 常規環境（左）與腫瘤微環境（右）下各組細胞的體外細胞毒性檢測

3. TME促進 CD8⁺T 細胞活化

流式細胞術分析表明，在AVATAR Odyssey模擬的TME條件（1% O₂，2 psi）下與靶細胞共培養後，CD8⁺ T細胞的活化標誌物表達比例顯著高於NE組（圖3）。這表明TME馴化有助於維持或增強效應T細胞的活化狀態。

圖3. CD4⁺/CD8⁺T 細胞活化、耗竭標誌物分析

4. 武裝型hCAR-T與腫瘤細胞的結合誘導Th1型細胞因子/趨化因子

將MCF-7與四類T細胞（UTD、BAT、hCAR、ahCAR）共培養18小時後，檢測上清液因子。熱圖顯示，ahCAR-T細胞在與腫瘤抗原結合後，顯著誘導了Th1型細胞因子（IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-2）、炎癥性因子（IL-6）及多種趨化因子（MIP-1α/β、IP-10、RANTES等）的分泌，表明其具備重塑TME免疫微環境的潛力（圖4）。

圖4. 各組細胞共培養後細胞因子/趨化因子表達譜

實驗結論

1. 在TME擴增條件（5% O₂，5 psi）下，hCAR表達中位值（50%）顯著高於常規環境

2. 無論NE或TME，CD8⁺T 細胞始終以TNaïve、TEMRA亞群為主，表型穩定。

3. ahCAR-T與腫瘤細胞結合後，可分泌多種具備免疫調節及腫瘤殺傷作用的細胞因子、趨化因子。

4. 流式細胞術檢測結果顯示，在TME（1% O₂和2 psi）條件下共培養的CD8⁺T細胞，各類活化標誌物陽性率更高。

綜上所述，借助 AVATAR Odyssey 系統在細胞體外擴增階段模擬實體瘤微環境，能夠顯著增強 ahCAR-T 細胞的抗腫瘤殺傷功能與免疫調控能力，為實體瘤 CAR-T 細胞優化方向提供實驗室數據支撐與可落地的技術方案。

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