2026.07.08

作為全球女性第四大惡性腫瘤，宮頸癌的臨床治療仍受困於腫瘤微環境中癌症相關成纖維細胞（CAFs）所構築的免疫抑製屏障，常規療法療效因此大幅受限。成纖維細胞活化蛋白（FAP）在CAFs及部分宮頸癌細胞表麵特異性高表達，為突破免疫逃逸提供了理想靶點。CAR-NK細胞兼具精準靶向與天然殺傷優勢，本研究基於CELLCYTE X 實時活細胞成像係統，在二維（2D）共培養與三維（3D）腫瘤球體雙模型體係中，係統評估了靶向FAP的第三代CAR-NK細胞對宮頸癌的體外殺傷效果。

結果顯示，抗FAP CAR-NK細胞能高效清除FAP陽性宮頸癌細胞及CAFs，而對FAP陰性細胞無顯著脫靶殺傷作用，驗證了其高特異性與強效細胞毒性。該研究為FAP靶向的實體瘤免疫治療策略提供了可靠的實驗依據。

材料與方法

1. 基於 CELLCYTE X 活細胞成像係統的細胞毒性檢測

二維（2D）細胞毒性實驗

將 5000 個經 mCherry 熒光標記的靶細胞（CaSki 細胞、原代宮頸癌細胞）接種於 96 孔培養板；CAFs 采用紅色熒光示蹤劑標記。次日按照不同效應細胞 / 靶細胞（E:T）比例加入 NK 細胞，其中 CAFs 與 NK 細胞固定效靶比 1:1 共培養。 NK-92 細胞使用添加 400 IU/mL 白細胞介素 - 2（IL-2）的 RPMI-1640 完全培養基培養；原代臍帶血 NK 細胞（pNK）使用含 400 IU/mL IL-2、35 ng/mL 白細胞介素 - 15（IL-15）的 NK MACS 專用培養基培養。將培養板置於 CELLCYTE X 活細胞成像係統中，每 2 h 自動成像 1 次，連續監測 72 h，動態分析靶細胞存活與增殖狀態。

三維（3D）腫瘤球體毒性實驗

單一腫瘤球體模型：將 1000 個 mCherry 標記的靶細胞接種於超低吸附 96 孔板，常規培養 3 天形成穩定 3D 腫瘤球體。按不同 E:T 比例加入含 400 IU/mL IL-2 的 NK-92 細胞，置於 CELLCYTE X 活細胞成像係統中，每 4 h 成像 1 次，持續監測 72 h。

混合腫瘤球體模型：將 500 個 mCherry 標記 CAFs 與 500 個 eGFP 標記宮頸癌細胞（SiHa/HeLa）混合接種，培養 3 天構建模擬原生腫瘤微環境的混合球體。後續加樣、成像參數與單一球體模型一致。

2. 其他輔助實驗

本研究聯合多種分子生物學與細胞生物學技術開展機製驗證：采用免疫組織化學、流式細胞術定量檢測宮頸癌組織、細胞係及原代細胞中 FAP 的表達水平；利用 α 逆轉錄病毒自失活（SIN）載體構建第三代抗 FAP CAR 載體並製備病毒上清；使用重組纖連蛋白片段、Synperonic F-108 試劑分彆輔助 NK-92 細胞與原代臍帶血 NK 細胞完成病毒轉導；通過實時熒光定量 PCR（qPCR）檢測載體拷貝數、蛋白質免疫印跡（Western blot）驗證 CAR 蛋白表達；利用流式細胞術定量檢測共培養體係中殘留靶細胞、檢測 CD107a 表達水平，評價 NK 細胞脫顆粒與活化能力；采用 LEGENDplex 多重流式試劑盒檢測細胞上清中細胞因子、細胞毒性相關蛋白的分泌量。所有實驗數據均使用 GraphPad Prism 軟件進行雙因素方差分析等統計學檢驗。

實驗結果

1. 抗 FAP CAR-NK-92 細胞對 FAP 陽性宮頸癌細胞的殺傷效果

以高表達 FAP 的 CaSki 細胞為靶細胞開展 2D 殺傷實驗，結果顯示：抗 FAP CAR-NK-92 細胞的殺傷作用具有劑量依賴性。在 0.5:1、1:1、5:1 三種 E:T 比例下，相較於未修飾 NK-92 細胞、ΔCAR-NK-92 細胞，抗 FAP CAR-NK-92 細胞均可顯著縮減 mCherry 陽性靶細胞熒光麵積。當 E:T 比例達到 5:1 時，抗 FAP CAR-NK-92 細胞幾乎完全清除 CaSki 細胞；而未修飾 NK-92 組和 ΔCAR-NK-92 組分彆擴增 3.18 倍、4.28 倍。即便在低 E:T 比例（0.5:1）條件下，CAR 組仍可顯著抑製靶細胞增殖，靶細胞僅擴增 1.73 倍。同時，殺傷效應在共培養數小時內即可快速顯現，反映出該細胞具備高效的殺傷動力學特征（圖 3B、3C）。以上結果證實，抗 FAP 修飾可顯著增強 NK-92 細胞對 FAP 陽性宮頸癌細胞的靶向殺傷能力。

圖3.抗 FAP CAR-NK-92 細胞對宮頸癌細胞的殺傷效果

2. 抗 FAP CAR-NK-92 細胞的靶向特異性驗證

來自 5 例患者的原代 CAFs 單獨培養 24~48 h 後，熒光麵積擴增 2 倍，增殖活性顯著。共培養體係中，未修飾 NK-92 細胞對 CAFs 殺傷能力有限，而抗 FAP CAR-NK-92 細胞可有效清除 CAFs（圖 4B）；共培養 48 h 後，原本呈梭形的 CAFs 形態轉變為圓形（補充圖 S8），該形態變化在兩個對照組中均未出現。實驗選取 FAP 陰性的原代宮頸癌細胞 CP5、CP17 開展特異性驗證：兩類細胞增殖能力很強，48 h 內熒光麵積分彆擴增 6.9 倍、3.5 倍。各實驗組 NK 細胞僅能輕微抑製其增殖，且抗 FAP CAR-NK-92 細胞與未修飾 NK-92、ΔCAR-NK-92 細胞的殺傷效果無統計學差異（圖 4C，補充圖 S10）。上述結果明確：抗 FAP CAR-NK-92 細胞僅靶向殺傷 FAP 陽性細胞，具備優異的抗原特異性。

圖 4. 抗 FAP CAR-NK-92 細胞清除原代宮頸癌來源的細胞

S8.原代宮頸癌症相關成纖維細胞的細胞毒性實驗結果

S10.原代宮頸癌細胞毒性實驗成像圖

3. 3D 單一腫瘤球體模型中的殺傷效果

構建 CaSki 細胞及多例原代 CAFs（CP2、CP3、CP4、CP6）3D 腫瘤球體，單獨培養 72 h 內球體總熒光強度保持穩定。共培養結果表明：不同 E:T 比例下，抗 FAP CAR-NK-92 細胞均可顯著降低 CaSki 球體熒光強度；ΔCAR-NK-92 細胞雖有微弱殺傷作用，但無統計學差異（圖 5A）。相較於單一癌細胞球體，抗 FAP CAR-NK-92 細胞對 CAFs 球體的殺傷效果更強：E:T=1:1 時，CP2 球體培養 34 h 熒光強度下降 50%，72 h 降幅達 83%；CP3 球體可被完全清除，提升 E:T 比例還能進一步縮短起效時間。CP4 球體在實驗早期可被 CAR 細胞有效殺傷，後期與對照組效果趨於一致；培養 72 h 後，抗 FAP CAR-NK-92 細胞幾乎完全清除 CP6 球體，殺傷效果顯著優於對照組（圖 5A）。

圖 5.抗 FAP CAR-NK-92 細胞對 3D 腫瘤球體的清除效果

4. 3D 混合腫瘤球體模型中的殺傷效果

利用 eGFP 標記宮頸癌細胞（SiHa、HeLa）與 mCherry 標記原代 CAFs（CP2、CP3、CP6）構建混合 3D 球體，模擬真實腫瘤微環境。

形態觀測發現：CAFs 集中於球體核心，宮頸癌細胞環繞其外周（圖 6A），該空間分布規律不受細胞接種順序影響；單獨培養的 CAFs 熒光強度 72 h 內基本穩定，與癌細胞共培養後熒光出現自然衰減（圖 6A）。在 E:T=1:1 條件下，未修飾 NK-92 細胞、ΔCAR-NK-92 細胞僅能造成球體核心鬆散，對 CAFs 殺傷作用極弱；而抗 FAP CAR-NK-92 細胞可使 CAFs 熒光強度下降 90%，殺傷效果突出。針對 CP3、CP6 來源 CAFs，抗 FAP CAR-NK-92 細胞同樣展現出高效殺傷能力（圖 6B），進一步證明其在複雜三維腫瘤微環境中，仍可穩定穿透並靶向清除免疫抑製性CAFs。

圖 6. 混合 3D 球體模型中抗 FAP CAR-NK 細胞清除宮頸癌症相關成纖維細胞

5. 原代臍帶血 CAR-NK 細胞的抗腫瘤活性評價

單獨培養的 CaSki 細胞 72 h 內熒光麵積擴增 9.6 倍。1:1 E:T 比例下，pNK 可明顯抑製靶細胞增殖，整體活性優於 NK-92 細胞，但不同供體來源 pNK 細胞存在活性差異，部分供體細胞可使靶細胞熒光麵積下降 15%~25%（圖 7C）。 經抗 FAP CAR 修飾後，pNK 細胞的殺傷能力大幅提升：培養 72 h 後，3 名供體來源的 CAR-pNK 細胞分彆使靶細胞熒光麵積下降 51%、63%、67%。細胞因子檢測結果顯示：pNK 細胞與 CaSki 細胞共培養後，sFasL、IFNγ、TNFα、顆粒酶 B 等活化及細胞毒性相關因子分泌量顯著上調。其中，2 號供體 CAR-pNK 細胞殺傷能力提升，與 IFNγ、顆粒酶 B 分泌增加直接相關；其餘細胞因子表達水平在各組間無明顯差異（圖 7C）。

圖 7. 臍帶血來源原代抗 FAP CAR-pNK 細胞清除宮頸癌細胞

實驗結論

本研究成功構建了第三代抗 FAP CAR-NK 細胞，可在 2D 共培養體係、3D 腫瘤球體（單一 / 混合）模型中，高效、特異性地殺傷 FAP 陽性宮頸癌細胞與癌症相關成纖維細胞，對 FAP 陰性細胞無明顯作用，靶向安全性良好。

在整個研究體係中，CELLCYTE X 活細胞成像係統發揮了核心作用：依托定時連續成像功能，每 2 h 或 4 h 實時追蹤熒光標記靶細胞的形態、數量及熒光強度變化，直觀量化 CAR-NK 細胞的殺傷動力學；精準捕捉到 CAR-NK 細胞數小時內快速起效並破壞 3D 混合球體結構的動態過程，為體外藥效評價提供了可視化、可量化的核心數據。

綜上，抗 FAP CAR-NK 細胞可同時靶向宮頸癌細胞與腫瘤微環境中的 CAFs，有效突破免疫抑製屏障，是治療宮頸癌的一種潛在有效療法，同時該策略也可拓展應用於其他 FAP 高表達的腫瘤及纖維化相關疾病。

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